venerdì 19 marzo 2010

fisica degli acidi nucleici - DNA, RNA, LNA

Questo mese esce il quinto numero del Carnevale della fisica, pubblicato sul blog di Annarita Ruberto, molto apprezzata per i suoi interventi sulle scienze, matematica (varie edizioni del carnevale della matematica).
Riprendo quindi il tema di alcuni post passati introducendo studi di fisica del DNA e dell'RNA, i due acidi nucleici che contengono l'informazione genetica, e su come si sono ampliate la nostre conoscenze nel corso degli ultimi anni, grazie ai contributi di biologi, medici e fisici.

Locked Nucleic Acid
Gli acidi nucleici sono costituiti da mattoncini qui schematizzati composti da uno zucchero, una base azotata e dei legami esteri tra gli zuccheri successivi. l'RNA ed il DNA si differenziano perchè nel DNA l'acido deossiribonucleico è privo dell' idrossile OH in 2' sul ribosio. La base azotata può essere una delle 4 presenti: timina (o uridina nell'RNA), guanina, adenina o citidina. Grazie a questi appaiamenti tra basi che si affacciano sui 2 filamenti di una doppia elica, avviene il riconoscimento tra un DNA ed il suo complementare, o tra un DNA ed un RNA complementare.
Lo studio degli acidi nucleici si è avvalso dell'apporto dei fisici che ne hanno studiato il comportamento in soluzione, in presenza di un doppio filamento, e di come la doppia elica si comporta diversamente tra DNA ed RNA. I primi dati sono stati ottenuti mediante l'analisi di diffrazione ai raggi X (Patterson) sui due filamenti orientati in direzione opposta, e in seguito da Wilkins (1953). Nello stesso anno uscì il lavoro con i dati di Watson e Crick. La cristallografia, che in genere si applica a strutture che sono state costrette a formare cristalli, è stata applicata anche a confermare i patterns di struttura delle fibre di DNA, che racchiudono un parziale ordine interno.
Anche le misurazioni di Vibrational optical activity, un particolare ramo di Dicroismo circolare vibrazionale (VOA misura lo stiramento tra carbonio e idrogeno in presenza di acqua triziata) è stato utilizzato per misurare polimeri complessi come gli acidi nucleici.

Introduzione di analoghi dello zucchero e nuovi acidi nucleici di sintesi.
Nell'LNA è presente uno zucchero modificato ciclico, Locked, con un legame interno tra l'ossidrile in 2' ed in 4'. La presenza di questo zucchero bloccato nei movimenti nell ospazio conferisce proprietà particolari ai filamenti di oligonucleotidi contenenti LNA
Un filamento di DNA contenente LNA sottosta ad una limitazione fisica di movimento che costringe l'acido nucleico ad assumere una conformazione rotazionale identica a quella propria dell'RNA (a destra).

Immagine tridimensionale elaborata sulla base della struttura ottenuta con le analisi fisiche

Gli oligonucleotidi contenenti LNA obbediscono alla regola di appaiamento di Watson-Crick (T-A, G-C), posseggono elevata affinità di formazione di doppia elica (T melting = +2 - 8’C per base), così che il filamento
- si ibrida facilmente e stabilmente con una sequenza complementare di RNA
– Migliora la specificità di appaiamento tra le basi azotate nell'ibridazione
gli oligonucleotidi contenti LNA, quando si legano con l'RNA, la fanno con più alta specificità e sensibilità nei saggi sull'RNA (Northern blot, ibridizzazione in situ) che possono essere condotte a temperature elevate proprio per quegli 8 gradi in più rispetto ad un acido nucleico tradizionale.
L'LNA viene sintetizzato come mattoncino per produrre, mediante sintesi chimica di oligonucleotidi, filamenti di DNA dopati RNA-like. Gli oligonucleotidi così ottenuti sono usati in DNA microarrays (MicroRNA array), o come sonde per ibridazione in tessuti e su membrana.
Un evento che ha determinato il successo della Exiqon è stato la scoperta che gli oligonucleotidi non devono contenere troppi LNA, perchè diventano idrofobici, e precipitano in soluzione. La Exiqon da allora sintetizza oligonucleotidi con pochi LNA distributi ogni 4-5 basi azotate, e questo è sufficiente per dare solubilità ed anche specificità di ibridazione con sequenze complementari.
Chi produce ed ha il brevetto degli LNA è una azienda danese, nata nel 1996.

La Exiqon, sotto la guida scientifica di Sakari Kauppinen, ha partecipato a diversi progetti europei tra il 2003 ed il 2006 (Riboreg, GOCE fish-and-chip), e mediante colaborazioni internazionali (Ronald Plasterck)ha dato la prima prova che l'espressione di singoli microRNA è tessuto specifica che si succedono o sovrappongono durante lo sviluppo ed il differenziamento in zebrafish (immagine ripresa da Wienholds et al. Science 2005).

Oggi l'Exiqon è il fiore all'occhiello della Comunità Europea, indicata come una azienda di successo che è cresciuta dai Programmi Quadro di ricerca europea, anche se lo sarebbe diventata a prescindere. Infatti, già nel 2006 avea originato la Santaris, finalizzata alle applicazioni terapeutiche di oligonucleotidi (trials clinici nei tumori e nelle malattie degenerative, come antiMiRs e anti-Bcl2).


In questi anni sono stati determinanti i progressi nella strumentazione per l'analisi degli acidi nucleici, che permettono di risparmiare sulle quantità necessarie. Nei primi anni fino al 2005, si doveva partire da qualche microgrammo di RNA totale per accedere all'espressione differenziale, oggi con uno spettrofotometro a contatto, usando solo un microlitro di RNA, già se ne conosce la purezza e la concentrazione. Con altri accorgimenti (amplificazione lineare dell'RNA messaggero o adattatori sui microRNA) si riesce a lavorare con 50-100 nanogrammi.
Gli spettrofotometri sono strumenti che leggono, (mediante un monocromatore che scompone la luce mediante filtri), l'assorbimento e l'emissione di luce di una soluzione, lungo uno spettro che va dai raggi UV (dai 210 nanometri fino a 400 nanometri) alla luce visibile (fino a 750 nanometri). Nel link è riportata l'equazione che lega il valore di emissione alla concentrazione del soluto, data dalla legge di Lambert e Beer. Il passo in avanti rispetto ai vecchi spettrofotometri è stato di evitare l'uso della cuvetta di quarzo, che può contenere almeno 50 microlitri, e di passare alla lettura a contatto, riducendo i volumi di RNA consumato di 50 volte.
Il risultato di questa analisi è dato dal valore di emissione a 280 nm, in cui assorbono sia gli acidi nucleici che gli amminoacidi aromatici, ed il valore di assorbimento a 260 nm, proprio degli acidi nucleici. Negli anni '90 e anche dopo, quando ancora non si avevano a disposizione questi strumenti, si valutava la concentrazione (per concentrazioni basse di DNA o RNA, sotto la soglia di rilevazione dello spettrofotometro) mediante corsa su gel di agarosio e estrapolazione per paragone cun i DNA markers di diverso peso molecolare.

Alcuni cenni su scoperte e su 2 grandi ricercatori dell'RNA nella riboregolazione

Joan Steitz (Prof. J. Argetsinger-Steitz, Yale Univ.) è una delle grandi pioniere della ricerca sull'RNA, RNA dei complessi riboregolatori (Ribonucleoproteine), e non-coding RNA piccoli come i microRNA. Trent'anni addietro quando separava l'RNA totale sui gel di acrilammide, osservava sul fronte di corsa dei piccoli RNA marcati (radiattivi), che venivano considerati come prodotti di degradazione, e lasciati eluire.
Da una sua intervista e Epigenie:
"Steitz: I think the most interesting finding was the RNA stuff that run at the front of our polyacrylamide gels. We were all labeling cells with P32 and getting incorporation and then running gels that would fractionate small RNAs. There was always this big band right at the front of the gel, and we said, “Oh, that's a degradation product.” But that isn't what it was. It was really mostly microRNAs, and some degradation products. Then people switched to indirect methods, like Northern blots, where you only find what you're probing for, and since they weren't probing for the stuff at the front of the gel, microRNAs went another two decades without being discovered".

Un altro grande appassionato di RNA è il Dr. George Calin, uno dei pionieri degli onco-MiRs, i microRNA riboregolatori che controllano lo sviluppo dei tumori, in particolare del sangue. Ha studiato in Romania, sua terra d'origine, ed ha preso e svolto il dottorato presso il laboratorio del Dr. Massimo Negrini, Università di Ferrara, prima di emigrare negli Stati Uniti, al Kimmel Cancer Center di Philadelphia, PA, presso il laboratorio del Dr. Carlo Croce. Una grande soddisfazione per la ricerca italiana in Italia e all'estero.

lunedì 15 marzo 2010

marzo in salento

Domenica trascorsa in campagna, a raccogliere verdura (bietole) e prendere il primo sole sul lungomare, con probabile avvistamente di una rondine spersa in cielo, e delle prime foglioline verde chiaro sugli alberi di fico.
Zolle di terra sull'aspro terreno a lastroni di pietra (cùti)
albicocco fiorito da una settimana...

Dal mio ufficio, giardino botanico....

giovedì 11 marzo 2010

scienceblogging: Dorothy Hodgkin


Per celebrare i 350 anni della Royal Society, la UK Royal Mail ha stampato una serie di francobolli con i 5 Nobel inglesi, Alfred Russel Wallace, Joseph Lister, Ernest Rutherford, Dorothy Hodgkin e Nicholas Shackleton.
Su wikipedia una breve ma densa sintesi dei risultati dell'unica donna Nobel inglese.
Dorothy Mary Crowfoot Hodgkin (Il Cairo, 12 maggio 1910 – Shipston-on-Stour, 29 luglio 1994) è stata una biochimica britannica, fondatrice della diffrazione dei raggi X e vincitrice del premio Nobel per la chimica nel 1964, «per la determinazione delle strutture di importanti sostanze biochimiche tramite l'uso di tecniche legate ai raggi X>>
Tra le biomolecole delle quali Hodgkin determinò la struttura figurano il colesterolo (1937), la penicillina (1945), la vitamina B12 (1954), l'insulina (1969), la lattoglobulina, la ferritina, e il virus del mosaico del tabacco.
Una Biografia della scienzata è stata pubblicata da Granta (1998), a cura di Georgina Ferry (Dorothy Hodgkin: a life), esplorandone l'aspetto umano e letterario della ricercatrice.
In suo nome, la Royal Society elargisce ogni anno alcuni finanziamenti alla ricerca per la durata di 4 anni. (Website)
Number Offered: Varies. Approximately 10 each year.
Application Closing Date: 20 January 2010
Closing Information: This round is now open
Apply for this grant:
http://e-gap.royalsociety.org/
Success rate: 2.5%

martedì 9 marzo 2010

scienceblogs - websites di bellezze della natura



Prima notizia: un bel sito di foto naturalistiche, insetti, uccelli, fiori selvatici, e informazioni su come rendere più attraenti i nidi e i mangimi.
Tutto questo su Derelia (website).

Gene Shuffling: come aumentare la variabilità genica anche negli organismi che si riproducono per partenogenesi.

Lucertola dalla coda a frusta - female whiptail lizards
Le lucertole che si riproducono asessualmente riescono a mantenere la diversità genetica con uno stratagemma: DNA shuffling, che sta per rimescolamento, che avviene perchè si instaura un raddoppio dei cromatidi proprio come nella divisione cellulare, e durante questo appaiamento avvengono eventi di ricombinazione genica localizzata.

Whiptail lizards (genus Aspidosceli), have been long studied for their asexual capabilities - about one-third of 50 species reproduce exclusively by parthenogenesis. At first, scientists suspected the lizards might be biological flukes destined for extinction, but studies showed the contrary: the lizards maintained excellent genetic diversity.

Fonte: Nature 22.2.2010, The Scientist (website)

Una domanda si pone:se questo metodo mantiene la variabilità genetica, che funzione in più hanno i piwi-RNA e il meccanismo delle regolazione epigenetica mediata da small RNAs nelle cellule uovo e spermatocita)?
ai giovani l'ardua soluzione...

Arneo delle ginestre

Sabato ho fatto una camminata nel bosco dell'Arneo (Punta Prosciutto).
Ginestre fiorite, tutta la vegetazione in crescita (bruscandoli, asparagi) e fischi di uccelli in sottofondo. Il bello del bosco è che ci si può perdere, per poi ritrovarsi.
In tutti i sensi. Una volta sono uscito in un uliveto ed ho dovuto ripercorrere la strada statale per qualche chilometro per raggiugnere l'auto parcheggiata.
L'aria è tiepida, profuma di primavera e di mare (siamo al di qua della statale, di là c'è la spiaggia). Questo è un rametto di pungitopo, dai colori così accesi...

giovedì 4 marzo 2010

canali via satellite

Oggi 2 notizie al volo.
Guardando le trasmissioni in lingua altra, ci si rende conto dei termini inusuali.
Chili. Tutto quello che lega il Cile al peperoncino, scoperto nei servizi sul terremoto in lingua francese. Tutto un mondo di Solanaceae con origine latino americana (peperone, pomodoro, patata).
Canadia. Come la chiamano gli altri (trasmissione in tedesco sulla diretta della finale di Hockey Canada-USA)

Domani è il grande giorno. Ospitiamo 5 dirigenti di una grande azienda giapponese, con 14500 dipendenti, attiva nel settore del packaging alimentare, dei prodotti alimentari per la grande distribuzione (bevande, pasti pronti) pronti a siglare un accordo di colaborazione con il CNR.

La primavera avanza, anche i pruni selvatici sono in fiore

lunedì 1 marzo 2010

appena tornato? no, appena partito

Sabato pomeriggio, una bella giornata con vento ponentino, siamo andati al mare (Porto Cesareo) per fare una passeggiata. Camminando, mi è venuto da dire: ecco, in qesto momento, mio nipote sta per atterrare ad Acapulco! (non è che stia andando in Messico, no) ... e inizierà una crociera di 2 mesi!!!
ma che, la crociera dura due mesi? non durano una settimana?
sì, ma lui è imbarcato come cuoco, stanno in viaggio 2 mesi e poi gli tocca un mese a terra. Contratto buono, contributi e copertura pensionistica (prima volta nella sua vita, anche se ha già lavorato alle Canarie, alle Baleari, e nel Cuneese in importanti ristoranti).
E' una nava varata nei cantieri navali di Trieste, e fa una rotta sia tropicale (Caraibi) sia polare (Alaska).
E' una grande emozione, tante responsabilità e tanti nuovi contatti, i compagni di lavoro, nuovi porti in cui scendere, climi diversi... intanto, il primo giorno all'arrivo sosta forzata: tutte le navi erano in all'erta per l'allarme tsunami.
Ah! non bisogna accettare provocazioni a bordo, ogni dipendente coinvolto in un alterco viene sbarcato al primo porto... da contratto!
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